Мой CRISPR-эксперимент превратился в кошмар... Что делать?! — разработка

Фундаментальная наука / Биология и генетика

Bio_Hacker_Max от 20-04-2026, 13:58

Похожее

Что за чертовщина с этим новым термоядерным реактором?! Энергетика будущего
Что за невезение с сервоприводами??? Помогите! Робототехника и мехатроника
Как я однажды чуть не сжег архив института История науки
Гайд по погружению в историю науки: как раскопать настоящие жемчужины! История науки
Гайд по выбору первого дрона для начинающего космического энтузиаста! — научный форум Космонавтика и авиация

Комментарии 5

Dr_Kozlov опубликовано: 20 апреля 2026 14:38

Bio_Hacker_Max, понимаю твои метания. Это реально выматывает, когда вкладываешь столько сил, а результата нет. Но давай по порядку.

Ты упомянул, что менял sgRNA, Cas9 и плазмиды. Хорошо. А что насчет эффективности доставки? Это, кмк, один из самых частых подводных камней в таких вот научных исследованиях. Через какие векторы ты пробовал доставлять компоненты? Лентивирус, аденовирус, или, может, напрямую вводил?

И еще такой момент: какой именно штамм мышей используешь? Есть же линии, которые могут быть более резистентны к определенным типам редактирования или иметь свои особенности экспрессии генов, которые маскируют эффект. Иногда приходится подбирать не только sgRNA, но и саму стратегию редактирования, особенно если ген большой или имеет сложную регуляцию

Анализировал ли ты вообще экспрессию Cas9 и sgRNA в клетках-мишенях? Может, там проблема с самим экспрессионным кассетным блоком или с условиями культивирования, если ты проводил предварительные тесты in vitro. Короче, надо копать глубже, а не только на уровне реагентов.

По опыту скажу, иногда приходится прибегать к комбинированным подходам, особенно когда речь идет о таких новых технологиях. Например, использовать два sgRNA для более полного нокаута или применять редактирование оснований, если прямой нокаут не дает нужного эффекта. И, конечно, не забывай про контрольные эксперименты. Всегда.

Ну и финальный аспект, который часто упускают: валидация самого фенотипа. Может, он и есть, но проявляется не так, как ты ожидаешь, или требует специфических условий для проявления. Тут, знаешь, очень важно чётко определить что именно ты ищешь и как это должно выглядеть.

CodeMaster_99

CodeMaster_99 опубликовано: 20 апреля 2026 22:26

Dr_Kozlov, насчет доставки — это классика. Но там, имхо, дело глубже. Смотрел ли ты валидацию sgRNA? Бывает, что она просто не привязана к цели, даже если в базе она норм. Ну типа, in silico тест прошел, а in vitro — фейл.

Если смотреть характеристики, то эффективность Cas9 зависит от многих факторов, включая структуру хроматина в точке интервенции. Может, у тебя участок гена XYZ слишком плотно упакован, и фермент просто не может туда добраться. Это одна из причин, почему CRISPR — это все еще поле для многих научных исследований, несмотря на все новые технологии.

Вот тебе конкретный кейс: у меня был проект, где мы пытались нокаутировать ген, расположенный в гетерохроматине. По всем параметрам — sgRNA, доза Cas9 — все было идеально. Но результат был нулевой. Пока не применили модифицированный вирус для доставки, который лучше проникает в плотные участки хроматина. Ну и плюс, надо было подобрать sgRNA, которая специфична именно для открытого участка промотора.

Короче, прежде чем грешить на сам CRISPR, разберись с логистикой доставки и биохимией участка, куда бьешь. Это больше похоже на эти подводные камни, о которых Dr_Kozlov говорит. Там могут быть и off-target эффекты, которые маскируют твой основной результат, если фенотип слабый.

КМК, стоит попробовать провести ПЦР для детекции разрезов на ДНК в клеточной культуре ДО инъекции мышам. Это даст прямую валидацию работы системы. Или, если есть возможность, секвенировать нужный участок гена для подтверждения отсутствия белка. Это уже ближе к инновациям в плане анализа.

--------------------

всем привет! рад общению

TechGuru_Alex

TechGuru_Alex опубликовано: 21 апреля 2026 21:10

TechGuru_Alex сегодня, 14:35

Dr_Kozlov, ты верно про доставку подметил. Это прям больная тема для многих, кто работает с новыми технологиями редактирования генома

А вот CodeMaster_99, ты вообще в точку про валидацию sgRNA. Это, знаешь, как строить дом без фундамента. Вроде все красиво, но рухнет при первом же чихе. Есть же сейчас куча софта для предикции эффективности, но это не отменяет необходимости потом проверить прямо на клетках. Не просто посадить клетки и ждать чуда, а именно провести реальные эксперименты по эффективности разрезания. Попробуй вот что:

Генотипирование: Прежде чем в мышей лезть, убедись, что в культуре клеток (если ты брал их из того же источника, что и для мышей) CRISPR реально работает. Возьми клетки, которые ты будешь трансфицировать, сделай там нокаут, а потом проверь методом секвенирования или qPCR, насколько стабильно и эффективно происходит редактирование.
Анализ "off-target" эффектов: Иногда проблема не в том, что ген не разрезается, а в том, чтоCas9 "гуляет" по геному и режет, где не надо. Это тоже может влиять на фенотип, причем непредсказуемо. Высокопроизводительное секвенирование (NGS) тебе в помощь.
Контрольные группы: Ты их делаешь, я надеюсь? Не просто "дикие" мыши, а еще и те, что получили только вектор без sgRNA, или sgRNA без Cas9. Это поможет отсечь артефакты, связанные с самой процедурой трансфекции или сборки конструкции.

Ну и вообще, Bio_Hacker_Max, помни, что научные исследования — это часто итеративный процесс. Не получилось с первого раза — это не конец света, а повод глубже копнуть и понять, где именно произошел сбой. Держись там!

--------------------

из Робототехника и мехатроника если что

Skeptik_Ivan

Skeptik_Ivan опубликовано: 24 апреля 2026 19:49

Tech_Noob

Tech_Noob опубликовано: 27 апреля 2026 08:29

--------------------

—