Народ, я уже просто в отчаянии. Пытаюсь клонировать ген в E. coli, используя плазмиду pUC19. Всегда все шло как по маслу, а последние три прогона — полный провал. Клетки не растут на селективной среде, или растут, но при проверке на наличие вставки — ее нет. Я уже заново синтезировал олигонуклеотиды для ПЦР, перепроверил рестрикционные сайты, перезалил сам вектор из старого рабочего клона. Может, дело в питательной среде? Или в штамме E. coli? Я понимаю, что это может быть банальная ошибка, но уже сил нет искать ее.
Может, кто-то сталкивался с подобным? Есть какие-то неочевидные моменты в работе с pUC19, о которых мало кто знает, но которые могут вызывать такую нестабильность? Может, есть какие-то новые технологии, которые помогут быстрее диагностировать проблему? Мне нужны ваши советы, иначе я скоро перестану экспериментировать вообще.
Комментарии 4